夏沫到底爱谁复旦大学上海医学院年博士论文 材料与方法 实验材料及试剂 实验动物’怀 大鼠 指定时间的怀孕大鼠购 分为两组 常规食物组 实验器材手术相关仪器气体麻醉机 动物专用 体式手术显微镜 恒温水浴箱缺氧混合气体 提供。蛋白质电泳的仪器设备包括直流稳压电源 微量进样器 烧杯离心机 超声仪紫外分光光度仪。气相色 复旦大学上海医学院年博士论文 材料与方法 实验材料及试剂 实验动物’怀 大鼠 指定时间的怀孕大鼠购 分为两组 常规食物组 实验器材手术相关仪器气体麻醉机 动物专用 体式手术显微镜 恒温水浴箱缺氧混合气体 提供。蛋白质电泳的仪器设备包括直流稳压电源 微量进样器 烧杯离心机 超声仪紫外分光光度仪。气相色谱分析仪器设备包括 日本岛津公 生产的 气相色谱仪 采用石英毛细管柱 柱内涂有 氧化硅熔胶 采用氢焰离子化检 。定量 使用仪器 拘离心管公司 灭菌的 枪头脑立体定位注射相关仪器 脑立体定位仪 适用于小鼠 微量进样器 微量注射器 号针头 实验试剂 常规试剂均购 公司 实验用抗体来源 抗体抗体 抗体 复旦大学上海医学院 年博士论文 抗体 抗体 用于免疫荧光染色的荧光二抗购 公司 用于 标记的二抗购自 公司。 染色试剂盒购自 公司 封片剂 粉末购 公司蛋白质电泳洗脱液 公司 公司 公司蛋白浓度测定液 细胞裂解缓冲液蛋白酶剂 丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺 溶液 公司 常用溶液配制 生理盐水 水中多聚甲醛溶液 称取多聚甲醛 溶于 溶液至液体。停止加热后溶液 过滤 调节 避光保存备用。】 复旦大学上海医学院 年博士论文 与磷酸二氢钾氯化钠 氯化钾 加蒸馏水 溶解 调节 蒸水溶解。脑片储存液 蔗糖溶于 溶液中高压灭菌冷却后 加入 乙二醇溶液 最后定容至 储存于 冰箱 蔗糖溶于 的多聚甲醛溶液中 完全溶解后定容至 二甲苯乙醇溶液 冰醋酸 中性树胶封片剂 焦油紫染液 焦油紫粉末蒸馏水将粉末充分溶解 加入 醋酸钠溶液 冰醋酸 水中避光 保存。高锰酸钾溶液 高锰酸钾粉末溶于水中 充分混匀 使用前新鲜配制。 乙醇氢氧化钠溶液 乙醇溶液中氢氧化钠的终浓度为 调至用水定容至 溶于水调至 用水定容至 。其中 过硫酸铵将粉末溶解于水中 新鲜配制 样品缓冲液 蛋白上样缓冲液终浓度为 甘油一巯基乙醇 复旦大学上海医学院 年博士论文溴酚蓝。 电泳缓冲液 水中再加入 溶液 甘氨酸缓冲液溶于 水中 再加 甲醇 氯化钠溶于 备用。封闭液 脱脂奶粉溶于 溶液中。 抗体稀释液 脱脂奶粉牛血清白蛋白 溶于 溶液中。 实验方法 的食物干预及新生大鼠脑缺血缺氧模型的食物干预指定时间的怀孕大鼠购自 单笼饲养 昼夜周期为 实验过程中完全摄食。育龄雌性大鼠于怀孕后第二天分别给予常规食物和富含 的鱼油食物 常规食物 给予常规实验动物专用食物 其中 的含量为 。富含 拘鱼油处理组 常规食物中加含量为 的食物干预持续至分娩后 日龄新生大鼠置于热垫上维持动物体温在 在异氟醚吸入麻醉 异氟醚 维持麻醉状态 情况下 仔细分离左侧迷走神经与颈总动脉 术中注意避免牵拉损伤迷走神经 对分离后的颈总动脉进行永久性结扎手术 每只动物的手术时间不超过 对于术中麻醉过深或大出血的动物予以去除。手术结束后 将新生鼠放回母鼠身边恢复 密闭箱内缺氧缺氧气体为含 复旦大学上海医学院 年博士论文的混合气 持续缺氧 小时 缺氧结束后再次将新生鼠放回母鼠身边喂养 以备后续实验使用。正常对照组 假手术组 在麻醉状态下分离颈总动脉 不结扎 不缺氧。 脑组织切片染色 切片制备分别将缺血缺氧性脑损伤后 的动物麻醉 用生理盐水 多聚甲醛溶液灌注固定 然后将固定后的脑组织置于 的蔗糖溶液中脱水 用冰冻切片机 的脑组织冠状切片对于 实验动物组在前联合与海马层面间 每间隔十张提取一张用于 染色 分析梗塞体积。其余切片置于脑片储存液 中保存待用。染色实验步骤 将脑片贴于 明胶包被的载玻片上 置于烤片机上干燥 脱水依次将脑片浸入 的乙醇溶液中各 再依次浸入的乙醇溶液中各 在去离子水中过一下 染色放入焦油紫染液中染色 然后依次在 滴冰醋酸乙醇溶液中过一下 透明 依次经乙醇二甲苯 混合液 二甲苯各 封片 中性树胶封片 观察。将 染色的脑片 利用 药像分析系统 计算损伤侧组织缺失比率以及不同脑区组织缺失率计算公式如下 对侧半积一同侧半积 对侧半积 免疫荧光染色实验步骤漂洗 将从脑片储存液中挑出的脑片放入 中漂洗 每次封闭 漂洗后的脑片置于封闭液中 室温封闭 完全吸去封闭液加入用抗体稀释液稀释至工作浓度的一抗 过夜 复旦大学上海医学院 年博士论文 每次加入用抗体稀释液稀释至工作浓度的荧光标记的二抗 避光 室温 漂洗 吸去二抗稀释液 每次全程避光 贴片和封片 将染好的脑片贴于明胶包被的载玻片上 稍干燥后用 封片 避光 保存待观察。 染色染色步骤 将脑片贴于明 烘箱中干燥干燥的脑片浸入 乙醇氢氧化钠溶液中 依次浸入 乙醇溶液和去离子水中 将脑片浸入高锰酸钾溶液中 置于摇床上轻轻振摇以背景均一 浸入去离子水中 将脑片浸入新鲜配制的浓度为 染液 储存液 储存液加入 的乙酸溶液中 用去离子水漂洗 每次沥干水分 置于 烘箱中使脑片充分干燥 将完全干燥的脑片浸入二甲苯溶液中透明 封片。染色后的样品置于荧光显微镜下观察 激发光波长为 染色染色反应液 染色前 将试剂盒 标记缓冲液 加入 酶缓冲液 混匀。染色步骤漂洗 将从脑片储存液中挑出的脑片于 中漂洗 每次染色 将脑片放入 染色反应液中 避光 漂洗 漂洗 每次注意避光。阳性对照 将脑片预先用 重组体预处理 导致 链断裂 然后进行同样的染色步骤。阴性对照 在染色时 将脑片放入未酶缓冲液 的加入标 复旦大学上海医学院 年博士论文记缓冲液 其余步骤相同。染色样品可以直接封片后于荧光显微镜下观察 激发光波长为 检测波长。同时 也可以继续用于免疫荧光染色 后续的染色过程注意避光。 蛋白质电泳 蛋白电泳样品制备 总蛋白样品制备 将冻存的皮层组织切成小块置于离 用冰预冷的洗两次 离心 弃去上清液 尽量吸去组织沉淀中的磷酸缓冲液 匀浆器匀浆 静置冰上超声 收集上清备用核蛋白样品提取利用 公司细胞核蛋白提取试剂盒 按照说明完成 步骤如下 用冰预冷的洗一次 弃去上清液尽量吸去组织沉淀中的磷酸缓冲液 仪上最高速充分混匀细胞 冰浴 加入冰预冷的 置于 仪上最高速混匀 仪上最高速混匀离心 将上清转移置洁净的冰预冷的离心管中置冰上备用 细胞浆蛋白提取物 冰预冷的含有蛋白酶剂的重悬沉淀 仪上最高速混匀。然后置于冰上 之后每 高速混匀 连续 复旦大学上海医学院年博士论文 离心 收集上清于清洁离心管中 置冰上备用。 蛋白浓度测定取 每孔加蛋白标准品样品 将蛋白浓度测定液 稀释 入每孔中反应分钟 紫外分光光度仪测定光密度值对应于用 标准品作出的标准曲线 得到各样品的蛋白浓度。 蛋白样品预处理将取自不同处理组的等量蛋白样品与 样品缓冲液混匀 水浴煮沸离心 置于冰上备用。 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验步骤 将自制的分离胶或购买的 梯度胶固定于电泳装置中 加入 电泳缓冲液 用微量进样器将蛋白标准品 烬经上述变性处理的蛋白样品分别加入各孔中电泳 加样后接通电源 红正黑负 立即进行电泳 初电压控制在 待样品进入分离胶后加大至 当燃料达到分离胶底沿时停止电泳 电泳完毕将电泳凝胶与固定装置分离 把凝胶、甲醇浸润过的 膜、滤纸在转移缓冲液中浸泡 然后按照 转移夹 负极 一纤维垫一滤纸一凝胶一 滤纸一纤维垫一转移夹正极 的顺序制备“三明治”。然后将制成的“三明治”对应于转移电泳槽的正负极插入槽中 加入转移缓冲液 置于冰浴中 电泳 封闭转膜结束将 膜放入封闭液中 于水平摇床上室温封闭 将封闭后的膜放入含有一抗的抗体稀释液中 每次然后将 膜放入 标记的二抗稀释液中 于水平摇床 室温 作用 显影 弃去二抗稀释液 每次。同时 液等体积混合把洗好的 膜的蛋白面向下置于上述混合液中作用 。然后将 膜用单蹭塑料薄膜包裹固定于暗盒中显影 洗脱 显影结束 洗脱之后再用 每次再次重复封闭一一抗一二抗一显影 复旦大学上海医学院 年博士论文步骤 检测其他蛋白的表达。 脂肪酸含量测定 样品采集缺血缺氧性脑损伤后 取大脑皮层组织用手术剪剪开幼鼠头皮和头盖骨后 分离大脑皮层组织并称重 将脑组织捣成匀浆 经冷冻干燥成粉状后待用。 脂肪酸的提取采用直接酯化法从上述收集到的样品中提取总脂肪酸。步骤如下 标本 干燥的脑组织 甲醇苯溶液 含内标 充分混匀 缓慢加入 氯乙酰溶液 勾衬的螺旋盖盖紧试管水浴中加热 并不断振摇稍冷却后加入 碳酸钾溶液 分钟吸取上层液相备用。 气相色谱分析实验步骤如下 采用自动进样吸取上述离心后的收集的样品 分析条件进样室温度为 压力为 总流量 进样方式为分流进样 分流比为 检测室温度为氢气流量 空气流量为 载气为氮气 流速为 柱流量为 线速度为 。采用程序升温法 初始温度为 维持 维持至分析结束 总程序时间 神经功能评估短期行为功能评估 观察新生大鼠脑缺血缺氧手术后 天的神经反射功能 将术后及同日龄对照组的新生鼠置于仰卧位 测定其翻身后四肢同时触地 恢复正常体位 所需要的时间。 复旦大学上海医学院 年博士论文 将新生鼠放在一直径为 的圆中心 测定其双前肢同时踏出该圆的时间。 长期行为功能评估 观察新生大鼠脑缺血缺氧损伤引起的远期行为功能改变 包括运能和学习记忆功能 评估脑损伤后 周的动物运能具体操作方法如下 将实验动物置于一个长 由个边长为的网孔组成的水平上 分别计数实验动物的前肢和后肢在上行走的步数 评估缺血缺氧性脑损伤后周动物的认知功能 具体操作方法如下 水迷宫分为四个象限 将一圆形平台固定于水迷宫的第一象限 低于水面 的深度 实验分两个阶段 第一阶段——学习期 将实验动物分别于第二、三、四象限的指定随机放入水中 动物入水时面向水池壁 由安装于水迷宫正上方的摄像头动物 内在水中的运动情况 包括游泳速度、经过各象限的时间和距离、到达平台的潜伏期等指标。如果动物在 内未能到达平台 由实验操作人员引导其找到平台 动物到达平台后 让其在平台上滞留 后再进行后续实验。第二阶段——记忆期 将平台从第一象限移走 把经过前一阶段训练的动物于同样的随机放入水中 动物入水时面向水池壁 由安装于水迷宫正上方的摄像头动物 为在水中的运动情况 包括游泳速度 经过各象限的时间和距离 经过之前平台所在的次数等指标。 脑室立体定位注射实验步骤缺血缺氧术前 将实验动物用 的异氟醚吸入麻醉后 固定于脑立体定位仪上 微量注射器固定在与脑立体定位仪配套的微量进样器上抽取 将针头定位于前囟后 向左旁开 的速度注射注射结束后留针 缓慢移出。 定量 皮层脑组织 的提取 【精品论文文献】omega3多不饱和脂肪酸在新生大鼠脑缺血缺氧损伤中的作用及机制研究,不饱和脂肪酸,多不饱和脂肪酸,单不饱和脂肪酸,不饱和脂肪酸单甘10e0脂,长链多不饱和脂肪酸,不饱和脂肪酸的食物,不饱和脂肪酸的作用,不饱和脂肪酸的危害,什么是不饱和脂肪酸
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